Bất mãn với các chính sách của Sa hoàng Pavel, giới quý tộc Nga lên kế hoạch ám sát nhà vua. Một âm mưu ám sát đã được đặt ra bởi các sĩ quan Ludwig von der Pahlen, Nikita Petrovich Panin và tướng Ribas, sĩ quan Zubov là chủ mưu. Những viên sĩ quan này hầu hết là bất mãn với việc làm của Sa hoàng, nhất là việc Pavel khui ra các hoạt động tham nhũng của công, chính sách cải cách quân đội Nga mất lòng người, Pahlen cùng một số người bất mãn khác và giới quý tộc tức giận. Bứt xúc vì bất ngờ bị giải chức Thống đốc thủ đô, der Pahlen cùng với N. Zubov tham gia vào âm mưu chống nhà vua[32]. Riêng Zubov là người thân cận của tiên hoàng Ekaterina II của Nga, bị Pavel nghi ngờ là có âm mưu thuyết phục Nữ hoàng Nga ký một bản di chúc chuyển ngôi cho cháu là Aleksandr, cũng là con trai cả của Sa hoàng Pavel. sau khi bị trục xuất khỏi thủ đô, ông ta bí mật liên kết với chị gái là hoàng hậu Olga Zherebtsova, xin hậu thuẫn về tài chính của chồng người chị là viên đại sứ Anh là Charles Whitworth, bá tước thứ nhất của xứ Whitworth, để phục vụ cho âm mưu ám sát của mình. Nhưng thực tế thì số tiền trợ giúp chính phủ Anh chuyển qua cho Whitworth để phục vụ cho việc lật đổ nhà vua đã bị vợ Whitworth chiếm đoạt[33]. Mặc dù vậy, chính phủ Anh cũng ra chỉ thị cho đại sứ Anh tại Nga: "Một khi mối quan hệ ngoại giao với Anh bị phá vỡ, Whitworth được lệnh phải rời khỏi thủ đô với tất cả nhân viên của mình"[34]. Có lẽ, vì sợ bị liên lụy đến âm mưu ám sát vua Nga, đại sứ Anh lặng lẽ rút về nước và chính phủ Anh lập tức cử nam tước Saint Helen sang thay vào tháng 4/1801[35].

Mặc dù không nhận được viện trợ gì từ Anh để phục vụ cho âm mưu, những tên sát thủ vẫn lập kế hoạch tiến hành ám sát nhà vua. Vào một đêm thứ hai lạnh giá ở St Petersburg, Sa hoàng tổ chức một bữa tiệc tối tại cung điện. Những người có mặt bao gồm các quý tộc và cả con trai cả Aleksandr, người đã ăn ít và dường như không được thoải mái[36]. Sau khi ăn tối, Pavel trở về nghỉ ngơi tại lâu đài Mikhailovsky[37]. Vài tiếng đồng hồ sau, một nhóm sĩ quan Nga do tướng Leo Bennigsen và von Pahlen cầm đầu, lặng lẽ tiến vào cung điện. Họ đánh gục hai người phục vụ, phá cửa rồi vào tận phòng ngủ của Pavel. Nhóm sĩ quan đang trong men say rượu cố gắng tiến lại gần Sa hoàng làm ông sợ hãi, chạy trốn ẩn sau một vài tấm màn ở góc tường. Họ lôi Sa hoàng ra, buộc ông ký vào văn bản thoái vị ngôi vua được đặt trên bàn. Hoàng đế Nga chống lại, thế là những tên sĩ quan bất ngờ tấn công ông. Hai bên giằng co quyết liệt. Nikolai Zubov đánh ông bằng thanh kiếm (có tài liệu ghi Zubov dùng cái hộp gỗ màu trắng đánh trúng Hoàng đế), sau đó những kẻ nổi loạn xông lên thắt cổ Hoàng đế bằng khăn quàng cổ và dẫm đạp ông đến chết, lúc đó là gần 1 giờ sáng ngày 24/3/1801[38].

Sau khi Pavel bi ám sát, một trong số những kẻ ám sát nhà vua là Zubov đã đến gặp Đại vương công Aleksandr (mới lúc đó 23 tuổi) ở phòng khác của lâu đài và nói: "Đã đến lúc rồi, hãy đi ra và cai trị thôi". Những tên sát thủ không bị tân đế trừng phạt, vì chúng lấy chứng cứ là chỉ ép Hoàng đế ký chiếu thoái vị thôi, nhưng nhiều kẻ uống rượu say đã làm quá tay khiến nhà vua thiệt mạng. sau đó cả bọn vẫn sống ung dung và thường được Hoàng đế mới của Nga tiếp kiến chung ở Cung điện mùa Đông. Tân đế Aleksandr I còn chỉ thị cho bác sĩ người Scotland là James Wylie viết báo cáo khám nghiệm rằng, Sa hoàng qua đời vì bệnh đột quỵ[37]; ra lệnh phải ước xác cha mình tử tế[39].

Tuy nhiên giấy không gói được lửa, châu Âu đã nhanh chóng biết tin và ngán ngẩm với "tai nạn" đáng phàn nàn về mặt y học đó. Napoléon Bonaparte sau đó đã đọc cho viên Ngoại trưởng Pháp viết hẳn một bức thư gần như mỉa mai trực tiếp tội giết cha, khiến Aleksandr nhục nhã ê chề. Tân Sa hoàng bèn công khai chỉ trích Napoleon là độc tài, rằng mình cảm thấy luyến tiếc về sự tiêu vong của cộng hòa Pháp (trong khi ông ta lại là hoàng đế của một đế quốc chuyên chế được xây dựng trên cơ sở chế độ nông nô)[37]